FADS-Based Universal Ultra-High-Throughput Evolution of Transaminases Using a Dual-Functional Probe
苏州医工所马富强与浙江大学邹宏斌团队联手创新转氨酶进化方法：
基于FADS（天木生物DREM cell）的转氨酶超高通量进化，助力远端突变位点的发现。
导语
近日，苏州医工所马富强团队在ACS catalysis发表了题为“FADS-Based Universal Ultrahigh-Throughput Evolution of Transaminases Using a Dual-functional Probe”的研究论文，提出了一种基于双功能探针与荧光激活液滴分选技术的超高通量转氨酶进化平台，成功将转氨酶活性提升197倍，并在仅3分钟内完成对上百万突变体的筛选。
其中，双功能探针（6-（1-氨乙基）萘-2-基）甘氨酸（N1），与荧光激活液滴分选（FADS）相容，同时可以作为氨基供体和转氨酶进化的荧光前体，这使得活性直接与荧光能联系起来。我们将其应用于筛选R-选择性ω-转氨酶AtTA的饱和突变库和随机突变文库，从超过400万个变体中，经过四轮分选有效地鉴定了突变体M21（R128W和远端E257G），实现了197倍的高比活力值。分子动力学模拟表明，远端E257G突变协同放大了R128W的作用，通过改善底物结合和催化效率促进药物中间体（R）-1-苄基哌啶-3-胺的转化。这项工作建立了一个转氨酶通用适配的超高通量进化平台，以克服转氨酶工程中长期存在的挑战。
图1 现有转氨酶筛选方法以及本文基于荧光激活微滴分选（FADS）的超高通量筛选策略
创新点：
1.新型探针N1适用于不同类型的转氨酶和氨基酸接受体，并适用于FADS筛选平台。经过四轮筛选，从超过400万个变体中高效地识别出来具有197倍更高特异性活性的M21。这种首个与FADS兼容、具有广泛底物范围的转氨酶进化筛选平台显著减少了大量的开发时间和成本；
2.突变体M21表现出增强的生物催化性能，其动力学参数显著改善，药物中间体（R）-1-苄基哌啶-3-胺的转化率显著提高（6小时内达到94.46%）。额外的分子动力学模拟提供了更深入的机制见解，表明远端的E257G突变协同增强了R128W的效果。这种结构动力学的改善与实验动力学的增强之间的正相关关系为M21的卓越性能提供了连贯的机制解释；
3.这套方法作为一种强大的工具，可用于培育具有卓越催化效率和热稳定性的高效转氨酶突变体。它能够通过与合理设计相结合，在NNK全饱和库中发现有益的突变体，并且还能独立于机器学习辅助，从随机库中识别出新的远端突变。
内容
1.双功能探针及其在FADS的应用
研究团队设计并合成了双功能探针rac-(6-(1-氨基乙基)萘-2-基)甘氨酸（N1）。该探针同时作为氨基供体和荧光前体，在转氨酶催化下生成产物N2，即(6-乙酰萘-2-基)甘氨酸，后者可发出绿色荧光。探针N1与产物N2的激发/发射波长分别为350/418 nm和404/508 nm，光谱重叠极小，避免了交叉干扰。N2在0至200微摩尔浓度范围内呈现线性荧光响应，便于定量检测。在连续365 nm紫外照射5小时后，N2仍保留73.63%的初始荧光强度。此外，N2的logD值在pH 8.5时约为-2，具有良好亲水性，满足液滴分选对低扩散的要求。N1可在10 mM磷酸盐缓冲液中直接溶解至100 mM，无需助溶剂。在液滴实验中，10 mM N1仅呈现背景荧光，而相同浓度的N2则发出强烈绿色荧光，且液滴在12小时内保持稳定，无明显荧光衰减或扩散。该探针在多种转氨酶中均能产生可检测的荧光信号，显示出良好的普适性。
图2 N1与N2的性质
2.FADS驱动的AtTA超高通量进化
（R）-1-苄基哌啶-3-胺（(R)-BPA）是诸如林格列汀、阿格列汀和特拉格列汀等药物合成过程中的关键中间体，它是（R）-1-哌啶-3-胺的前体，而后者在药物化学中具有重要意义。在此，我们提出了如图3a所示的技术路径，在该路径中，羰基前体1-苄基哌啶-3-酮（BPO）和双功能探针N1转化为(R)-BPA和N2。通过微流控分析和微孔板读取定量监测了N2的酶促形成过程，荧光强度（与N2浓度成正比）作为转氨酶催化效率的实时指标。为了验证FADS平台在转氨酶导向进化中的应用，我们选择了来自Aspergillus terreus的R-选择性ω-转氨酶AtTA作为起始酶，并执行了如图3b所示的筛选流程。
图3 通过FADS实现AtTA超高通量进化的工作流程
对定点饱和突变文库进行一轮荧光激活液滴分选后，阳性液滴比例增加2.59%。通过微孔板验证89个克隆，获得多个单点突变体，其中R128W活性最高，比活力较野生型提升133倍，命名为M11。以M11为模板构建随机突变文库，经过三轮液滴分选，阳性液滴比例从初始的1.14%逐步提升至4.48%、7.85%和最终的9.82%（图4）。对264个变体进行微孔板验证，最终筛选出多个高活性候选变体。其中，将E257G突变引入R128W背景得到的双突变体R128W/E257G，命名为M21，其比活力较野生型提升197倍，较M11提升约1.5倍。
图4 FADS筛选结果与荧光信号统计
3.优秀突变体的活性及机理研究
通过联合FADS筛选和微孔板验证，研究成功获得了双突变体M21，其对底物BPO的催化活性显著增强。动力学表征显示（表1），以N1为氨基供体时，M11和M21的底物亲和力相当，Km值分别为1.73和1.77 mol·L⁻¹，均明显高于野生型AtTA。在M11基础上引入远端E257G突变得到的M21，虽然底物亲和力未进一步提升，但催化转化率和效率显著提高：kcat值较M11提升约77%，kcat/Km值提升约73%。总体而言，M21在底物结合和催化效率两方面均优于野生型AtTA和M11。
定量分析表明，M21的比活力较野生型AtTA提升197倍，较M11提升约1.5倍。在模拟FADS系统条件（10 mM异丙胺、2 mM BPO）下，M21在6小时内实现了94.46%的BPO转化率，对映体过量值超过99%。以上结果与荧光检测法一致，证实了基于双功能探针的FADS平台是一种通用、超高通量的转氨酶进化系统。
表1 野生型与突变体的动力学参数及活性
随后，采用AlphaFold3进行蛋白结构预测，通过分子对接和分子动力学模拟解析突变体的催化机制。R128W突变将精氨酸替换为色氨酸，在活性口袋中引入吲哚基团，增强了活性位点的疏水特性。该突变使得底物BPO的苯环发生翻转，与周围的色氨酸184、酪氨酸60、苯丙氨酸115和苯丙氨酸217形成π-π堆积相互作用，稳定了活性中心构象，促进了底物进入活性通道。动态交叉相关图分析显示，R128W突变减少了全局的反向相关运动，增强了活性口袋附近的刚性。引入E257G突变后，蛋白质的正向相关性显著增强，不仅局限于257位点局部，还与128位点产生协同效应，形成了更紧密的动态耦合网络。半径回转和吉布斯自由能图谱分析表明，从野生型到M11再到M21的进化轨迹，呈现出从分散、高波动状态向紧凑、低波动稳定状态的转变，增加了催化活性构象的占有率和持续时间。
值得注意的是，E257G位于距离活性中心约14.6埃的远端，位于β-折叠与环区的交界处。该突变通过蛋白质的侧向运动，拓宽了底物进入通道，并使底物哌啶环向活性口袋内移动约1 Å，从而改善了底物结合效率。
总结
本研究成功开发了一种基于双功能探针N1和荧光激活液滴分选技术的超高通量转氨酶进化平台。定点饱和突变文库的筛选仅需3分钟，即可实现5倍覆盖，与传统方法相比，筛选时间和试剂消耗均减少95%以上。该平台从低活性的AtTA出发，成功获得双突变体M21，比活力提升197倍，底物转化率达94.46%，对映体过量值超过99%。尤为重要的是，该平台识别了远端突变E257G，这一位点位于酶表面，远离活性中心，无法通过传统的理性或半理性设计预测。这一结果充分体现了随机突变库筛选在发现功能性远端突变方面的独特优势。该双功能探针在多种转氨酶中均能产生荧光信号，表明该平台具有良好的普适性，可推广至其他缺乏天然荧光信号的酶类，为酶工程领域提供了一种高效、低成本、广谱适用的超高通量筛选工具。
FADS-Based Universal Ultra-High-Throughput Evolution of Transaminases Using a Dual-Functional Probe
苏州医工所马富强与浙江大学邹宏斌团队联手创新转氨酶进化方法：
基于FADS（天木生物DREM cell）的转氨酶超高通量进化，助力远端突变位点的发现。
导语
近日，苏州医工所马富强团队在ACS catalysis发表了题为“FADS-Based Universal Ultrahigh-Throughput Evolution of Transaminases Using a Dual-functional Probe”的研究论文，提出了一种基于双功能探针与荧光激活液滴分选技术的超高通量转氨酶进化平台，成功将转氨酶活性提升197倍，并在仅3分钟内完成对上百万突变体的筛选。
其中，双功能探针（6-（1-氨乙基）萘-2-基）甘氨酸（N1），与荧光激活液滴分选（FADS）相容，同时可以作为氨基供体和转氨酶进化的荧光前体，这使得活性直接与荧光能联系起来。我们将其应用于筛选R-选择性ω-转氨酶AtTA的饱和突变库和随机突变文库，从超过400万个变体中，经过四轮分选有效地鉴定了突变体M21（R128W和远端E257G），实现了197倍的高比活力值。分子动力学模拟表明，远端E257G突变协同放大了R128W的作用，通过改善底物结合和催化效率促进药物中间体（R）-1-苄基哌啶-3-胺的转化。这项工作建立了一个转氨酶通用适配的超高通量进化平台，以克服转氨酶工程中长期存在的挑战。
图1 现有转氨酶筛选方法以及本文基于荧光激活微滴分选（FADS）的超高通量筛选策略
创新点：
1.新型探针N1适用于不同类型的转氨酶和氨基酸接受体，并适用于FADS筛选平台。经过四轮筛选，从超过400万个变体中高效地识别出来具有197倍更高特异性活性的M21。这种首个与FADS兼容、具有广泛底物范围的转氨酶进化筛选平台显著减少了大量的开发时间和成本；
2.突变体M21表现出增强的生物催化性能，其动力学参数显著改善，药物中间体（R）-1-苄基哌啶-3-胺的转化率显著提高（6小时内达到94.46%）。额外的分子动力学模拟提供了更深入的机制见解，表明远端的E257G突变协同增强了R128W的效果。这种结构动力学的改善与实验动力学的增强之间的正相关关系为M21的卓越性能提供了连贯的机制解释；
3.这套方法作为一种强大的工具，可用于培育具有卓越催化效率和热稳定性的高效转氨酶突变体。它能够通过与合理设计相结合，在NNK全饱和库中发现有益的突变体，并且还能独立于机器学习辅助，从随机库中识别出新的远端突变。
内容
1.双功能探针及其在FADS的应用
研究团队设计并合成了双功能探针rac-(6-(1-氨基乙基)萘-2-基)甘氨酸（N1）。该探针同时作为氨基供体和荧光前体，在转氨酶催化下生成产物N2，即(6-乙酰萘-2-基)甘氨酸，后者可发出绿色荧光。探针N1与产物N2的激发/发射波长分别为350/418 nm和404/508 nm，光谱重叠极小，避免了交叉干扰。N2在0至200微摩尔浓度范围内呈现线性荧光响应，便于定量检测。在连续365 nm紫外照射5小时后，N2仍保留73.63%的初始荧光强度。此外，N2的logD值在pH 8.5时约为-2，具有良好亲水性，满足液滴分选对低扩散的要求。N1可在10 mM磷酸盐缓冲液中直接溶解至100 mM，无需助溶剂。在液滴实验中，10 mM N1仅呈现背景荧光，而相同浓度的N2则发出强烈绿色荧光，且液滴在12小时内保持稳定，无明显荧光衰减或扩散。该探针在多种转氨酶中均能产生可检测的荧光信号，显示出良好的普适性。
图2 N1与N2的性质
2.FADS驱动的AtTA超高通量进化
（R）-1-苄基哌啶-3-胺（(R)-BPA）是诸如林格列汀、阿格列汀和特拉格列汀等药物合成过程中的关键中间体，它是（R）-1-哌啶-3-胺的前体，而后者在药物化学中具有重要意义。在此，我们提出了如图3a所示的技术路径，在该路径中，羰基前体1-苄基哌啶-3-酮（BPO）和双功能探针N1转化为(R)-BPA和N2。通过微流控分析和微孔板读取定量监测了N2的酶促形成过程，荧光强度（与N2浓度成正比）作为转氨酶催化效率的实时指标。为了验证FADS平台在转氨酶导向进化中的应用，我们选择了来自Aspergillus terreus的R-选择性ω-转氨酶AtTA作为起始酶，并执行了如图3b所示的筛选流程。
图3 通过FADS实现AtTA超高通量进化的工作流程
对定点饱和突变文库进行一轮荧光激活液滴分选后，阳性液滴比例增加2.59%。通过微孔板验证89个克隆，获得多个单点突变体，其中R128W活性最高，比活力较野生型提升133倍，命名为M11。以M11为模板构建随机突变文库，经过三轮液滴分选，阳性液滴比例从初始的1.14%逐步提升至4.48%、7.85%和最终的9.82%（图4）。对264个变体进行微孔板验证，最终筛选出多个高活性候选变体。其中，将E257G突变引入R128W背景得到的双突变体R128W/E257G，命名为M21，其比活力较野生型提升197倍，较M11提升约1.5倍。
图4 FADS筛选结果与荧光信号统计
3.优秀突变体的活性及机理研究
通过联合FADS筛选和微孔板验证，研究成功获得了双突变体M21，其对底物BPO的催化活性显著增强。动力学表征显示（表1），以N1为氨基供体时，M11和M21的底物亲和力相当，Km值分别为1.73和1.77 mol·L⁻¹，均明显高于野生型AtTA。在M11基础上引入远端E257G突变得到的M21，虽然底物亲和力未进一步提升，但催化转化率和效率显著提高：kcat值较M11提升约77%，kcat/Km值提升约73%。总体而言，M21在底物结合和催化效率两方面均优于野生型AtTA和M11。
定量分析表明，M21的比活力较野生型AtTA提升197倍，较M11提升约1.5倍。在模拟FADS系统条件（10 mM异丙胺、2 mM BPO）下，M21在6小时内实现了94.46%的BPO转化率，对映体过量值超过99%。以上结果与荧光检测法一致，证实了基于双功能探针的FADS平台是一种通用、超高通量的转氨酶进化系统。
表1 野生型与突变体的动力学参数及活性
随后，采用AlphaFold3进行蛋白结构预测，通过分子对接和分子动力学模拟解析突变体的催化机制。R128W突变将精氨酸替换为色氨酸，在活性口袋中引入吲哚基团，增强了活性位点的疏水特性。该突变使得底物BPO的苯环发生翻转，与周围的色氨酸184、酪氨酸60、苯丙氨酸115和苯丙氨酸217形成π-π堆积相互作用，稳定了活性中心构象，促进了底物进入活性通道。动态交叉相关图分析显示，R128W突变减少了全局的反向相关运动，增强了活性口袋附近的刚性。引入E257G突变后，蛋白质的正向相关性显著增强，不仅局限于257位点局部，还与128位点产生协同效应，形成了更紧密的动态耦合网络。半径回转和吉布斯自由能图谱分析表明，从野生型到M11再到M21的进化轨迹，呈现出从分散、高波动状态向紧凑、低波动稳定状态的转变，增加了催化活性构象的占有率和持续时间。
值得注意的是，E257G位于距离活性中心约14.6埃的远端，位于β-折叠与环区的交界处。该突变通过蛋白质的侧向运动，拓宽了底物进入通道，并使底物哌啶环向活性口袋内移动约1 Å，从而改善了底物结合效率。
总结
本研究成功开发了一种基于双功能探针N1和荧光激活液滴分选技术的超高通量转氨酶进化平台。定点饱和突变文库的筛选仅需3分钟，即可实现5倍覆盖，与传统方法相比，筛选时间和试剂消耗均减少95%以上。该平台从低活性的AtTA出发，成功获得双突变体M21，比活力提升197倍，底物转化率达94.46%，对映体过量值超过99%。尤为重要的是，该平台识别了远端突变E257G，这一位点位于酶表面，远离活性中心，无法通过传统的理性或半理性设计预测。这一结果充分体现了随机突变库筛选在发现功能性远端突变方面的独特优势。该双功能探针在多种转氨酶中均能产生荧光信号，表明该平台具有良好的普适性，可推广至其他缺乏天然荧光信号的酶类，为酶工程领域提供了一种高效、低成本、广谱适用的超高通量筛选工具。
