近日，南昌大学食品科学与技术学院付桂明教授主导的研究成果“Deciphering the Molecular Adapting Mechanism of Lactic Acid-Tolerant Saccha-romyces cerevisiae Through Genomic and Transcriptomic Analysis”在《Foods》期刊上发表。
本研究采用常压室温等离子体(ARTP)诱变结合全自动高通量微生物液滴培养系统(Microbial Microdroplet Culture system，MMC)筛选出耐4%(v/v)乳酸的突变株NCUF309.5-44。此研究首次将多组学技术应用于白酒酿造酵母的耐乳酸机制研究，并发现该菌株通过激活GSH/GPx抗氧化系统、强化细胞膜质子泵功能及增强糖酵解代谢等协同机制提升耐受力。研究结果不仅为解析酵母耐乳酸机制提供新视角，还为工业菌株改良及固态白酒发酵工艺优化提供理论依据。
一、研究背景
1. 传统固态白酒酿造工艺的特点与挑战
传统中国白酒的固态酿造过程，发酵和蒸馏在无大量游离液体的条件下进行，酒醅作为发酵混合物，其环境因素在酿造过程中不断动态变化。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为酒醅发酵过程中的优势微生物，易受到多种环境胁迫因素影响，如有机酸、乙醇、温度波动和渗透压等。这些胁迫会导致发酵速率降低、还原糖降解减少，最终影响发酵效率和白酒品质。
2. 乳酸在固态白酒酿造中的关键作用与影响
在传统固态白酒酿造过程中，乳酸是最主要的有机酸，其积累(浓度可达3.62%±0.62%)会显著抑制酿酒酵母的生长和代谢，导致发酵效率下降及最终产品品质降低。针对高浓度乳酸胁迫下基因突变菌株的研究仍较为缺乏。
3. 酵母耐酸机制研究现状
目前，关于酵母对酸胁迫潜在机制的研究文献，主要集中在生物质转化和有机酸工业生产领域。例如，有研究表明酵母在木质纤维素转化过程中，可通过减缓某些氨基酸和核苷酸的合成、降低能量消耗，来增强对甲酸的耐受性并实现自我保护 ;还有研究发现酵母能够改变细胞壁结构以增加硬度，从而提高对乙酸胁迫的耐受性。但针对酿酒酵母在白酒酿造环境下对乳酸的耐受机制研究仍较为缺乏。
二、菌株培养与特性分析
1. 菌株培养：
①菌株选择与培养：
本研究选用了前期通过特定技术手段获得的耐乳酸酿酒酵母菌株NCUF309.5-44，以及野生型菌株作为研究对象。其中，耐乳酸菌株的获得，大气压室温等离子体(ARTP)诱变与微生物微滴培养(MMC)技术发挥了关键作用。
②培养条件设置：
将两种菌株分别接种于含有不同浓度乳酸的YPD培养基中，重点研究在4%(v/v)乳酸浓度下的生长情况，该浓度模拟固态白酒酿造中后期酒醅中较高的乳酸含量。在设定的时间间隔(如0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h等)取样，测定细胞生长密度(如OD600值)，绘制生长曲线，以了解菌株在乳酸胁迫下的生长动态。
③代谢性能测定：
通过对比耐乳酸菌株和野生型菌株在相同培养时间下的还原糖利用率和乙醇产量，评估乳酸胁迫对代谢性能的影响以及耐乳酸菌株在代谢方面的优势。
④抗氧化酶活性检测：
在不同培养时间点收集细胞，破碎后提取蛋白，采用相应的生化检测方法，测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等抗氧化酶的活性。分析抗氧化酶活性在乳酸胁迫下的变化趋势，探究菌株如何通过调节抗氧化系统来应对乳酸诱导的氧化应激。
⑤基因组分析：
①测序与数据获取：对耐乳酸菌株和野生型菌株进行全基因组重测序;
②序列比对与变异检测：将处理后的读段与酿酒酵母的参考基因组进行比对，统计SNP和Indel的数量、分布位置，确定在编码区、非编码区以及基因间区的变异情况。
③变异基因功能注释：对于检测到的发生变异的基因，借助各类数据库进行功能注释。
分析这些基因所参与的生物学过程、分子功能以及细胞组成相关信息，初步筛选出可能与乳酸耐受相关的基因。
⑥转录组分析：
①RNA提取与测序：分别提取在4 %
(v/v)乳酸胁迫下耐乳酸菌株和野生型菌株不同时间点的总RNA，确保RNA的完整性和纯度满足测序要求。采用高通量RNA测序技术(RNA-seq)，构建测序文库并进行测序，获取基因转录本的序列信息和表达量数据;
②数据处理与差异基因筛选：对测序得到的原始数据进行标准化处理，将读段比对到参考基因组上，计算每个基因的表达量。通过统计学分析方法，比较耐乳酸菌株和野生型菌株在乳酸胁迫下的基因表达谱，筛选出差异表达基因;
③差异基因功能富集分析：对筛选出的差异表达基因进行GO(Gene Ontology)功能富集分析，将基因归类到生物过程、分子功能和细胞组成三大类功能注释中，找出在乳酸胁迫下显著富集的GO条目，明确菌株在细胞代谢、应激反应等方面的变化。同时进行KEGG(Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，确定差异基因显著富集的代谢通路和信号转导通路，进一步揭示耐乳酸菌株应对乳酸胁迫的分子机制。
2. 菌株特性分析
①基因组水平的适应性进化
研究发现，乳酸耐受菌株在基因组水平表现出显著的适应性突变。这些突变主要集中在与质子转运、细胞膜完整性和应激响应相关的功能基因上。通过比较基因组分析，鉴定出多个与乳酸耐受性显著相关的单核苷酸多态性(SNPs)和插入缺失变异(Indels)，这些遗传变异共同构成了菌株耐受性的基础。
②转录调控网络的系统性重塑
在转录水平上，耐受菌株表现出全局性的基因表达重编程。核心调控因子的表达显著上调，激活了下游约200个靶基因的表达。这些靶基因主要涉及：①细胞膜转运系统;②离子稳态维持;③细胞壁生物合成。值得注意的是，糖酵解途径关键酶基因的表达普遍提高，而TCA循环相关基因则呈现差异化表达模式。
③氧化应激防御系统的强化
耐受菌株建立了多层次的抗氧化防御体系：①超氧化物歧化酶(SOD)活性提高;②过氧化氢酶(CAT)活性增加;③谷胱甘肽代谢相关酶活性显著增强。这些变化使菌株的ROS清除能力提升3倍以上，有效缓解了乳酸胁迫诱导的氧化损伤。同时，硫氧还蛋白系统和DNA修复酶的表达上调，进一步增强了细胞的修复能力。
图 1.原始菌株和乳酸耐受菌株之间
SNP 和 InDel 的 GO 注释 （a） 和 KEGG 富集 （b）
结果。
图 2.乳酸胁迫下原始菌株和耐乳酸菌株之间 DEGs 的 KEGG 富集分析结果 （（a）：上-DRGs;（b）：下 DEGs）
表 1 4%的乳酸对原始菌株和耐乳酸菌株抗氧化酶活性的影响。
四、研究亮点
1. 多组学整合揭示全局适应机制
首次通过基因组、转录组和代谢组的联合分析，系统解析了酿酒酵母乳酸耐受的多层次调控网络。鉴定出了58个关键基因突变和1235个差异表达基因。
2. 关键调控因子的发现与验证
研究首次阐明了转录因子协同调控乳酸耐受的新机制，鉴定出核心调控枢纽及其下游靶基因网络。基于这些发现成功开发出具有显著提升耐受性能的工程菌株，并建立了高效的分子标记筛选体系，体现了基础研究向应用转化的重要价值。
3. 防御系统的协同作用解析
研究深入揭示了抗氧化系统与细胞膜重塑在乳酸耐受中的协同保护作用，通过建立定量关系模型，为理解微生物应对环境胁迫的系统性适应策略提供了新见解，也为工业菌株的理性设计奠定了理论基础。
近日，南昌大学食品科学与技术学院付桂明教授主导的研究成果“Deciphering the Molecular Adapting Mechanism of Lactic Acid-Tolerant Saccha-romyces cerevisiae Through Genomic and Transcriptomic Analysis”在《Foods》期刊上发表。
本研究采用常压室温等离子体(ARTP)诱变结合全自动高通量微生物液滴培养系统(Microbial Microdroplet Culture system，MMC)筛选出耐4%(v/v)乳酸的突变株NCUF309.5-44。此研究首次将多组学技术应用于白酒酿造酵母的耐乳酸机制研究，并发现该菌株通过激活GSH/GPx抗氧化系统、强化细胞膜质子泵功能及增强糖酵解代谢等协同机制提升耐受力。研究结果不仅为解析酵母耐乳酸机制提供新视角，还为工业菌株改良及固态白酒发酵工艺优化提供理论依据。
一、研究背景
1. 传统固态白酒酿造工艺的特点与挑战
传统中国白酒的固态酿造过程，发酵和蒸馏在无大量游离液体的条件下进行，酒醅作为发酵混合物，其环境因素在酿造过程中不断动态变化。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为酒醅发酵过程中的优势微生物，易受到多种环境胁迫因素影响，如有机酸、乙醇、温度波动和渗透压等。这些胁迫会导致发酵速率降低、还原糖降解减少，最终影响发酵效率和白酒品质。
2. 乳酸在固态白酒酿造中的关键作用与影响
在传统固态白酒酿造过程中，乳酸是最主要的有机酸，其积累(浓度可达3.62%±0.62%)会显著抑制酿酒酵母的生长和代谢，导致发酵效率下降及最终产品品质降低。针对高浓度乳酸胁迫下基因突变菌株的研究仍较为缺乏。
3. 酵母耐酸机制研究现状
目前，关于酵母对酸胁迫潜在机制的研究文献，主要集中在生物质转化和有机酸工业生产领域。例如，有研究表明酵母在木质纤维素转化过程中，可通过减缓某些氨基酸和核苷酸的合成、降低能量消耗，来增强对甲酸的耐受性并实现自我保护 ;还有研究发现酵母能够改变细胞壁结构以增加硬度，从而提高对乙酸胁迫的耐受性。但针对酿酒酵母在白酒酿造环境下对乳酸的耐受机制研究仍较为缺乏。
二、菌株培养与特性分析
1. 菌株培养：
①菌株选择与培养：
本研究选用了前期通过特定技术手段获得的耐乳酸酿酒酵母菌株NCUF309.5-44，以及野生型菌株作为研究对象。其中，耐乳酸菌株的获得，大气压室温等离子体(ARTP)诱变与微生物微滴培养(MMC)技术发挥了关键作用。
②培养条件设置：
将两种菌株分别接种于含有不同浓度乳酸的YPD培养基中，重点研究在4%(v/v)乳酸浓度下的生长情况，该浓度模拟固态白酒酿造中后期酒醅中较高的乳酸含量。在设定的时间间隔(如0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、16h等)取样，测定细胞生长密度(如OD600值)，绘制生长曲线，以了解菌株在乳酸胁迫下的生长动态。
③代谢性能测定：
通过对比耐乳酸菌株和野生型菌株在相同培养时间下的还原糖利用率和乙醇产量，评估乳酸胁迫对代谢性能的影响以及耐乳酸菌株在代谢方面的优势。
④抗氧化酶活性检测：
在不同培养时间点收集细胞，破碎后提取蛋白，采用相应的生化检测方法，测定超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)等抗氧化酶的活性。分析抗氧化酶活性在乳酸胁迫下的变化趋势，探究菌株如何通过调节抗氧化系统来应对乳酸诱导的氧化应激。
⑤基因组分析：
①测序与数据获取：对耐乳酸菌株和野生型菌株进行全基因组重测序;
②序列比对与变异检测：将处理后的读段与酿酒酵母的参考基因组进行比对，统计SNP和Indel的数量、分布位置，确定在编码区、非编码区以及基因间区的变异情况。
③变异基因功能注释：对于检测到的发生变异的基因，借助各类数据库进行功能注释。
分析这些基因所参与的生物学过程、分子功能以及细胞组成相关信息，初步筛选出可能与乳酸耐受相关的基因。
⑥转录组分析：
①RNA提取与测序：分别提取在4 %
(v/v)乳酸胁迫下耐乳酸菌株和野生型菌株不同时间点的总RNA，确保RNA的完整性和纯度满足测序要求。采用高通量RNA测序技术(RNA-seq)，构建测序文库并进行测序，获取基因转录本的序列信息和表达量数据;
②数据处理与差异基因筛选：对测序得到的原始数据进行标准化处理，将读段比对到参考基因组上，计算每个基因的表达量。通过统计学分析方法，比较耐乳酸菌株和野生型菌株在乳酸胁迫下的基因表达谱，筛选出差异表达基因;
③差异基因功能富集分析：对筛选出的差异表达基因进行GO(Gene Ontology)功能富集分析，将基因归类到生物过程、分子功能和细胞组成三大类功能注释中，找出在乳酸胁迫下显著富集的GO条目，明确菌株在细胞代谢、应激反应等方面的变化。同时进行KEGG(Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析，确定差异基因显著富集的代谢通路和信号转导通路，进一步揭示耐乳酸菌株应对乳酸胁迫的分子机制。
2. 菌株特性分析
①基因组水平的适应性进化
研究发现，乳酸耐受菌株在基因组水平表现出显著的适应性突变。这些突变主要集中在与质子转运、细胞膜完整性和应激响应相关的功能基因上。通过比较基因组分析，鉴定出多个与乳酸耐受性显著相关的单核苷酸多态性(SNPs)和插入缺失变异(Indels)，这些遗传变异共同构成了菌株耐受性的基础。
②转录调控网络的系统性重塑
在转录水平上，耐受菌株表现出全局性的基因表达重编程。核心调控因子的表达显著上调，激活了下游约200个靶基因的表达。这些靶基因主要涉及：①细胞膜转运系统;②离子稳态维持;③细胞壁生物合成。值得注意的是，糖酵解途径关键酶基因的表达普遍提高，而TCA循环相关基因则呈现差异化表达模式。
③氧化应激防御系统的强化
耐受菌株建立了多层次的抗氧化防御体系：①超氧化物歧化酶(SOD)活性提高;②过氧化氢酶(CAT)活性增加;③谷胱甘肽代谢相关酶活性显著增强。这些变化使菌株的ROS清除能力提升3倍以上，有效缓解了乳酸胁迫诱导的氧化损伤。同时，硫氧还蛋白系统和DNA修复酶的表达上调，进一步增强了细胞的修复能力。
图 1.原始菌株和乳酸耐受菌株之间
SNP 和 InDel 的 GO 注释 （a） 和 KEGG 富集 （b）
结果。
图 2.乳酸胁迫下原始菌株和耐乳酸菌株之间 DEGs 的 KEGG 富集分析结果 （（a）：上-DRGs;（b）：下 DEGs）
表 1 4%的乳酸对原始菌株和耐乳酸菌株抗氧化酶活性的影响。
四、研究亮点
1. 多组学整合揭示全局适应机制
首次通过基因组、转录组和代谢组的联合分析，系统解析了酿酒酵母乳酸耐受的多层次调控网络。鉴定出了58个关键基因突变和1235个差异表达基因。
2. 关键调控因子的发现与验证
研究首次阐明了转录因子协同调控乳酸耐受的新机制，鉴定出核心调控枢纽及其下游靶基因网络。基于这些发现成功开发出具有显著提升耐受性能的工程菌株，并建立了高效的分子标记筛选体系，体现了基础研究向应用转化的重要价值。
3. 防御系统的协同作用解析
研究深入揭示了抗氧化系统与细胞膜重塑在乳酸耐受中的协同保护作用，通过建立定量关系模型，为理解微生物应对环境胁迫的系统性适应策略提供了新见解，也为工业菌株的理性设计奠定了理论基础。
